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關(guān)于細(xì)胞凍存液的操步驟詳細(xì)說(shuō)明

更新時(shí)間:2018-01-18 點(diǎn)擊次數(shù):5044
細(xì)胞凍存液操作步驟
(一)細(xì)胞凍存
1.配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,去除舊培養(yǎng)液,用PBS清洗,去除PBS,加入適量胰蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái), 離心1000rpm,5min;
2.去除胰蛋白酶,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×106/ml~1×107/ml,將細(xì)胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;
3.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng),凍存時(shí)間及操作者,凍存:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/ min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時(shí),則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。
(二) 細(xì)胞復(fù)蘇
1.從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化,從37℃水浴中取出凍存管,打開(kāi)蓋子,用吸管吸出細(xì)胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻;
2.離心, 1000rpm,5min;棄去上清液,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);
3.次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)
1.從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存,但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液;
2.將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),要做好防護(hù)工作,以免凍傷;
3.凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。
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