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CD34+造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染神器:ProteanFect Max

更新時(shí)間:2025-01-15 點(diǎn)擊次數(shù):18
CD34+造血干細(xì)胞是血液系統(tǒng)中的關(guān)鍵細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能。通過轉(zhuǎn)染技術(shù),可以研究基因功能并開發(fā)新的治療策略。ProteanFect Max作為一種高效的轉(zhuǎn)染試劑,已被證明能顯著提高mRNA轉(zhuǎn)染效率,且對細(xì)胞分化影響較小。

2. 材料與方法

2.1 CD34+造血干細(xì)胞的分選

使用動員人單采血或臍帶血,通過陽性選擇分選試劑盒分離CD34+細(xì)胞。推薦使用Lymphoprep™(Stemcell, 07861)作為分離試劑,以及CD34 MicroBead Kit, human(Miltenyi Biotec, 130-046-702)進(jìn)行細(xì)胞分選。

2.2 培養(yǎng)基的配制

  • SFEM II培養(yǎng)基(Stemcell, 09655)和StemSpan™ CC100(Stemcell, 02690)以99:1比例混合。
  • 若添加抗生素,需稀釋1000倍。
  • 配制完成后,培養(yǎng)基應(yīng)放置于4°C冰箱儲存,并盡量在1個月內(nèi)使用完。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

  • 分選后的CD34+細(xì)胞以300g離心5分鐘,用1 mL完·全培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。
  • 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果,將細(xì)胞重懸至105 cells/mL的密度,接種到T25培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。
  • 3天后補(bǔ)液一次,若進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),需調(diào)整細(xì)胞密度至2×105 cells/mL,并隔天補(bǔ)液。

2.4 轉(zhuǎn)染操作

  • 轉(zhuǎn)染核酸:mRNA。
  • 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基:使用Opti-MEM培養(yǎng)基或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養(yǎng)基。
  • 轉(zhuǎn)染體系:配置ProteanFect Max轉(zhuǎn)染體系,具體protocol需參考私戳獲取。
  • 細(xì)胞準(zhǔn)備:確保細(xì)胞活率超過90%,避免反復(fù)離心。
  • 轉(zhuǎn)染過程:孵育時(shí)間建議15分鐘,適當(dāng)延長可提高轉(zhuǎn)染率,但可能影響細(xì)胞活力。
  • 效率檢測:使用陽性對照mRNA,轉(zhuǎn)染后5-48小時(shí)內(nèi)觀察EGFP表達(dá)。細(xì)胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍(lán)、AO/PI染色或流式細(xì)胞術(shù)檢測。

3. 結(jié)果

使用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染的CD34+造血干細(xì)胞顯示出高達(dá)72.3%的mCherry+表達(dá)率,而未處理組僅為0.25%。此外,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的分化狀態(tài)未受顯著影響,CD71+CD235-細(xì)胞比例在轉(zhuǎn)染后第2天和第3天保持穩(wěn)定。

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